「摘要」 規(guī)避多胎妊娠風(fēng)險較好的方法是選擇性單胚胎移植，同時冷凍保存剩余胚胎。而囊胚的培養(yǎng)和移植在生理學(xué)上與子宮內(nèi)膜同步性最大。因此大部分學(xué)者認(rèn)為囊胚培養(yǎng)和冷凍尤為重要，特別是冷凍后選擇囊胚腔擴(kuò)展起來的囊胚移植。目前評估胚胎主要依靠形態(tài)學(xué)評估方法。本中心囊胚形成率為53.35%。

關(guān)鍵詞    選擇性單胚胎移植，囊胚

The blastocyst culture is very important for elective single embryo transfer

ZHONG Ying

(Reproductive Medicine Center,Jingjiang Maternal and Child Health Hospital, Hhengdu, Sichuan 610051, China)

Abstract  A good strategy to avoid multiple pregnancies is single embryo transfer (SET) with freezing of spare embryos. Blastocyst culture and transfer is adapted to physiological procedure, and resulted embryo-uterine synchrony. Therefore, More scholars believe that blastocyst culture and blastocyst vitrification is more important. The choice frozen blastocyst transfer should depend on blastocyst expansion after vitrification in blastocyst vitrification. Presently , morphology and cleavage rate used in many centers remain the mainstay of embryo assessment. In our center, blastulation rates was 53.35%.

Key words  Selective single embryo transfer, Blastocyst

1、囊胚培養(yǎng)的意義

自1978年,體外受精—胚胎移植已作為不孕癥治療的主要措施。隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床妊娠率有了很大的提高，但并發(fā)的多胎率增加了圍產(chǎn)期母嬰安全的風(fēng)險，且其他健康風(fēng)險仍將延續(xù)至圍產(chǎn)期以外。如何在保證妊娠率的同時又能降低多胎率，成為目前輔助生殖領(lǐng)域研究的關(guān)注焦點(diǎn)。2002年歐洲人類生殖與胚胎年會提出：“單胎分娩是ART的首選結(jié)局，雙胎妊娠應(yīng)當(dāng)視為ART的一項并發(fā)癥。”；國際生育協(xié)會聯(lián)盟（IFFS）提出的健康IVF結(jié)局：第一，關(guān)注育齡期婦女的健康改善公共衛(wèi)生狀況和目前保健最為重要，第二，推廣單胚胎移植，尤其對可具備胚胎冷凍條件的機(jī)構(gòu)，第三，建議全胚冷凍，通過復(fù)蘇移植單個凍融胚胎直至妊娠，減少母親產(chǎn)科不良預(yù)后的發(fā)生，減少出生嬰兒圍產(chǎn)期的傷害。因此選擇性單胚胎移植是目前公認(rèn)有效地解決這一問題的關(guān)鍵。在單胚胎移植中更多的學(xué)者認(rèn)為，單囊胚的移植和囊胚玻璃化冷凍是保證累計妊娠率的重要因素。

2、實施囊胚培養(yǎng)前需明確的幾個問題

胚胎實驗室在保證正常受精、正常受精卵的比例、及胚胎在相對客觀可評估的形態(tài)學(xué)評分體系中有序進(jìn)行，且種植前胚胎在不同發(fā)育階段均有成熟的冷凍標(biāo)準(zhǔn)和實施方案，是行囊胚培養(yǎng)的基礎(chǔ)。如何在囊胚培養(yǎng)的過程中對胚胎進(jìn)行評價、如何選擇性的進(jìn)行囊胚培養(yǎng)、如何提高囊胚冷凍的效率是實施囊胚培養(yǎng)前需明確的幾個問題。

2.1  胚胎序貫評分系統(tǒng)

在體外受精-胚胎移植技術(shù)中，卵子和胚胎質(zhì)量是影響妊娠結(jié)果的重要因素。目前對胚胎評估多依據(jù)形態(tài)學(xué)，在復(fù)雜的形態(tài)學(xué)評分系統(tǒng)中，建立一套符合自己中心特點(diǎn)的評分系統(tǒng)，本中心的經(jīng)驗是細(xì)化形態(tài)學(xué)來幫助我們選擇具有發(fā)育潛能和種植能力的胚胎。

胚胎形態(tài)學(xué)評估是一個連續(xù)的動態(tài)的過程，主要包括卵母細(xì)胞、原核、早卵裂、卵裂期及囊胚期。目前認(rèn)為理想的成熟卵母細(xì)胞胞漿清亮、均質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)顆粒均勻清晰、無空泡、碎片、無顆粒狀暗區(qū)，極體呈圓形或橢圓形、表面光滑，卵周隙小，透明帶清晰，卵母細(xì)胞質(zhì)量對其后胚胎發(fā)育至關(guān)重要[1,2]。Scott原核評分系統(tǒng)[3]輔助預(yù)測囊胚形成及胚胎發(fā)育的潛能。早卵裂胚胎是對受精25~27小時后對胚胎卵裂情況的觀察，有報道早卵裂[4]能有效的輔助判斷具有高種植潛能的胚胎。分裂期胚胎的形態(tài)學(xué)評分，胚胎發(fā)育速度、卵裂球均勻度、有無多核、碎片量常作為胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)。卵裂球大小與其非整倍體比例有關(guān),而多核的出現(xiàn)會嚴(yán)重地削弱胚胎的種植潛能[5]，碎片減少了正常細(xì)胞分裂的胞漿，影響胚胎卵裂球的緊密連接，碎片量在20%-40%，47%胚胎有染色體不正常[6]，而且碎片位置在卵裂間隙可引起不正常的融合和囊胚形成[7]，降低囊胚形成率、胚胎植入率并伴隨凋亡和染色體異常率增加。我中心胚胎實驗室主要依據(jù)原核數(shù)目、卵裂速度、卵裂球均勻度、多核、空泡、碎片程度這幾方面對胚胎進(jìn)行評估。

目前囊胚評分系統(tǒng)有兩種:Gardner和Dokras評分法，本中心主要是依據(jù)Gardner等[8，9]1990年提出的兩步評分系統(tǒng)：第一步根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵化程度將其評分：1期：早期囊胚，囊胚腔小于胚胎體積的一半；2期：囊胚腔大于胚胎體積的一半；3期：囊胚腔幾乎充滿整個胚胎；4期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔大于早期囊胚，透明帶變薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶孵出；6期：完全孵出的囊胚。再對3-6期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評分： 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的評分：A級細(xì)胞數(shù)多，緊密；B級細(xì)胞數(shù)少，松散；C級細(xì)胞數(shù)很少。滋養(yǎng)層細(xì)胞的評分：A級上皮細(xì)胞層由較多細(xì)胞組成，機(jī)構(gòu)緊密；B級上皮細(xì)胞層由少的細(xì)胞組成，機(jī)構(gòu)松散；C級上皮細(xì)胞層由稀疏細(xì)胞組成。形態(tài)學(xué)上評價囊胚的三個部分與種植率有密切的關(guān)系，作為單獨(dú)的因素滋養(yǎng)層細(xì)胞（數(shù)目和大?。ΨN植的影響最大；擴(kuò)展和內(nèi)細(xì)胞形態(tài)對種植的影響相對低些。

2.2 選擇性的囊胚培養(yǎng)

歐洲一些國家實施選擇性單囊胚移植的標(biāo)準(zhǔn)為[10]：①第一個或第二個促排卵周期，②女方年齡小于36歲，③D3有4個以上的優(yōu)質(zhì)胚胎。本中心根據(jù)自己實驗室的評分系統(tǒng)特點(diǎn)，通過形態(tài)學(xué)序貫的觀察，胚胎評估方法培養(yǎng)囊胚的指標(biāo)為：①≥35歲D3達(dá)到4枚或以上的優(yōu)質(zhì)胚胎，②＜35歲D3達(dá)到3枚或以上的優(yōu)質(zhì)胚胎，③＜35歲D3達(dá)到2枚優(yōu)質(zhì)胚胎和3枚以上的3級8細(xì)胞胚胎，則建議繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。本中心2008.1—2011.1月，≥35歲囊胚形成率為：48.51%；＜35歲的囊胚形成率為：54.34%。根據(jù)本中心的評分系統(tǒng)，優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成率為79.79%，3級胚胎的囊胚形成率為：69.10%。4級胚胎的囊胚形成率為12.30%。

2.3 囊胚的玻璃化冷凍技術(shù)

完善穩(wěn)定的冷凍技術(shù)是實現(xiàn)選擇性單胚胎移植的有力保障。大量的研究表明，玻璃化囊胚冷凍復(fù)蘇較卵裂期冷凍復(fù)蘇有更高的臨床妊娠率、種植率及活產(chǎn)率。特別是累積活產(chǎn)率更需要依賴于冷凍技術(shù)。本中心自2008年全部采用玻璃化冷凍技術(shù)，冷凍保護(hù)劑為7.5%DMSO+7.5%EG+5%HSA基礎(chǔ)液和15%DMSO+15%EG+0.5M Sucrose+5%HSA基礎(chǔ)液。復(fù)蘇液為0.35M Sucrose、0.2M Sucrose、5%HSA+基礎(chǔ)液，冷凍載體為冷凍環(huán)。本中心2008.1—2010.1囊胚冷凍復(fù)蘇存活率91.82%、妊娠率63.67%、種植率48.95%、多胎率37.01%、分娩率51.62%。

3、實驗室的培養(yǎng)條件

實施選擇性單胚胎移植特別是單囊胚移植，實驗室培養(yǎng)條件是基礎(chǔ)。囊胚培養(yǎng)延遲了胚胎在體外的時間，研究認(rèn)為低氧環(huán)境使氧自由基產(chǎn)物減少，并可結(jié)合或破壞培養(yǎng)基中的某些毒素，從而提高囊胚形成率。目前序貫培養(yǎng)液的使用為囊胚培養(yǎng)提供了保證。序貫培養(yǎng)液是根據(jù)胚胎不同發(fā)育階段的需求而設(shè)計的，滿足了胚胎的生理需求和營養(yǎng)物質(zhì)的需要，因此囊胚形成率較高。目前本中心使用的Thermo Forma三氣培養(yǎng)箱，氣體濃度為：CO26%, O25%, N289%，采用Cook Medical成品序貫培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。采用微滴分組方式培養(yǎng)。目前本中心的囊胚形成率為53.35%，與Ebner[11]報道相似。

4、國內(nèi)外囊胚培養(yǎng)的現(xiàn)狀

ART治療中降低多胎妊娠妊娠率，減少胚胎移植數(shù)目是一個有效的措施，關(guān)鍵是如何找到一個合適的切入點(diǎn)，既能不影響妊娠率的同時又有效的降低多胎率。實施單囊胚移植是方法之一，于此同時要求胚胎實驗室具備穩(wěn)定完善的培養(yǎng)條件，以期獲得較高囊胚的形成率，并且囊胚凍融技術(shù)將有力保證患者的累計妊娠率。

綜上所述，在擁有良好胚胎實驗室培養(yǎng)條件、序貫的胚胎形態(tài)學(xué)評分系統(tǒng)和穩(wěn)定的凍融技術(shù)下，實施選擇性單囊胚移植是可行的。

參考文獻(xiàn)

[1] Ebner T, Moser M, Tews G. Is oocyte morphology prognostic of embryo developmental potential after ICSI[J]. Reprod Biomed Online,2006,12(4):507-12.

[2] Sun YP, Xu Y, Cao T, et al. Zona pellucida thickness and clinical pregnancy outcome following in vitro fertilization[J]. Int J Gynecology Obstet,2005, 89(3):258-62.

[3] Sott L, Alvero R, Leondires M, et al. The morphology of human pronuclear and implantation[J]. Hum Reprod, 2000, 15(11): 2391-2403.

[4] Bos-Mikich, Mattos Al, Ferrari AN. Early cleavage of human embryos: an effective method for predicting successful IVF/ICSI outcome[J].Hum Reprod, 2001, 16 (12):2658-2661.

[5] Hardarson T, Hanson C, et al. Human embryos with unevenly sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates: indications for aneuploidy and multi-nucleation[J]. Hum Reprod, 2001, 16(2):313-8.

[6] Munne S, Cohen J. Chromosome abnormalities in human embryos[J].Hum Reprod Update,1998, 4:842-55.

[7] Alikani M, Cohen J, Tomkin G, et al. Human embryo fragmentation in vitro and its implications for pregnancy and implantation[J]. Fertil Steril,1999,71:836-842。

[8] Gardner D, Schoolcraft W. In vitro culture of human blastocysts[M].In: Jansen R, Mortimer D, eds. Toward reproductive certainty:fertility and genetics beyond 1999. Carnforth, UK: Parthenon Publishing, 1999:378-88.

[9] Gardner DK, Surrey E, Minjarez D, et al. Single blastocyst transfer: a prospective randomized trial[J]. Fertil Steril,2004: 81: 551-5.

[10] Guerif F, Frapsauce C, Chavez1 C, et. al. Treating women under 36 years old without top-quality embryos on day2:a prospective study comparing double embryo transfer with single blastocyst transfer[J]. Hum Reprod, 2011, 1 (2):1-7

[11] Ebner T, Shebl O, Moser M, et al. Group culture of human zygotes is superior to individual culture in terms of blastulation, implantation and life birth[J]. Reproductive Bio Medicine Online, 2010(21),762-768.